Пост-релиз: сателлитный симпозиум QIAGEN на XXII Российском онкологическом конгрессе


В новом выпуске журнала "Hi+Med Высокие технологии в медицине" выйдет пост-релиз прошедшего сателлитного симпозиума компании QIAGEN на XXII Российском онкологическом конгрессе.


Мы предлагаем вам уже сегодня ознакомиться с темами и основными выводами, которые затрагивали приглашенные лекторы в своих выступлениях.


Современные технологии QIAGEN: молекулярная диагностика на службе онкологии


Система секвенирования нового поколения NGS GeneReader на стенде компании QIAGEN

Людмила Николаевна Любченко, председатель симпозиума, д.м.н., заведующая лабораторией клинической онкогенетики НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина, приветствовала участников конференции и отметила, что сейчас «все больше и больше лабораторий используют методы секвенирования нового поколения (NGS) в своей клинической рутинной практике. Компания QIAGEN не только разрабатывает оборудование для секвенирования нового поколения для онкологических исследований, но и проводит обучение, позволяющее овладеть этой технологией, внедрить ее в клиническую практику».


Специалист по продукции QIAGEN, директор по продажам ООО «Медком» Алексей Аникаев представил доклад «Обзор клинического портфолио» и рассказал о комплексном подходе компании к оснащению лабораторий: «Компания QIAGEN занимает ведущие позиции на рынке решений для молекулярно-генетической диагностики в онкологии. Это все востребованные сегодня методы, в том числе секвенирование нового поколения. Для комплексного анализа генов (выявления новых вариантов, глубокого секвенирования генов, жидкостной биопсии, готовых решений для интерпретации результатов) разработана система GeneReader. Метод пиросеквенирования (анализ единичных генов, включающий рутинный анализ мутаций и количественный анализ степени метилирования генов) представлен пиросеквенатором PyroMark Q48 Autoprep. Эта альтернативная технология секвенирования позволяет проводить количественный и качественный анализ метилирования ДНК, что важно для изучения канцерогенеза, старения и других клеточных процессов. Для проведения метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени, предполагающего анализ единичных мутаций, используется амплификатор в режиме реального времени Rotor-Gene Q. На сегодняшний день это самый быстрый метод детекции заданных маркеров», – сообщил докладчик. Разработанные ПЦР наборы для детекции соматических мутаций сертифицированы в странах Европейского союза и США. Выявление мутаций в EGFR методом ПЦР в реальном времени сертифицировано и в России. Данная технология широко используется для выявления мутаций в различных онкогенах (EGFR –29 мутаций, KRAS – 7, BRAF – 5).



«Сегодня QIAGEN предлагает полный комплекс оборудования, реагентов и программного обеспечения для секвенирования следующего поколения. Помимо этого компания занимает лидирующие позиции в разработке решений для жидкостной биопсии. Это новая и эффективная технология детекции биомаркеров без необходимости инвазивного вмешательства. Образцами могут послужить кровь, сыворотка, плазма», – отметил А.Ю. Аникаев. На сегодняшний день есть ряд подходов для анализа бесклеточной свободно циркулирующей ДНК, мРНК и мкРНК, как ручными методами, так и с использованием высокопроизводительных роботов, чтобы автоматизировать и стандартизировать получаемые результаты. Выделенная таким образом из плазмы ДНК пригодна для последующего анализа ПЦР, NGS или другими методами.


C каждым годом появляется все больше маркеров, позволяющих спрогнозировать эффективность лечения, препараты назначаются с учетом данных молекулярных тестов. Раньше использовались одиночные тесты для выявления мутаций, например KRAS или BRAF, сегодня есть потребность в комплексных тестах. Докладчик привел пример – выбор таргетной терапии рака легких, при котором определяется геномный ландшафт образца опухоли, на его основе подбирается тактика лечения. Ожидается, что количество мишеней будет увеличиваться, в связи с этим остро встают вопросы: как много мутаций необходимо выявлять, как следует выполнять тестирование: переходить с последовательного тестирования к пареллельному и проводить комплексный анализ всех необходимых генов.

Спикер проанализировал возможности применения решения QIAGEN для NGS «от образца к результату». Данная технология позволяет качественно, комплексно и с высокой точностью произвести анализ интересующих мутаций. Первый этап – выделение ДНК или РНК (наборы реагентов QIAGEN для выделения ДНК из фиксированных тканей или свободно циркулирующей ДНК из образцов плазмы), затем – таргетное обогащение и создание библиотек (наборы реагентов для проведения целевого секвенирования генов с использованием секвенаторов нового поколения Thermo Fisher Scientific или illumina: MiSeq, NextSeq, HiSeq), далее – запуск секвенатора (система GeneReader от QIAGEN), анализ данных (программное обеспечение QIAGEN Clinical Insight Analyze), и завершающий этап – интерпретация (программное обеспечение QCI Interpret). GeneReader позволяет автоматизировать весь процесс анализа. Если в лаборатории уже имеется секвенатор нового поколения, QIAGEN предлагает универсальное портфолио реагентов для создания библиотек серии QIAseq.


QIAGEN аккумулирует в себе мировой опыт разработок в области молекулярной онкологии, в том числе решений в области биоинформатики. Это позволило создать базу знаний QIAGEN Knowledge base, включающую контент и решения для анализа, структуризации и интерпретации данных. «Таким образом, сегодня QIAGEN – одна из немногих компаний, которая близка к новой парадигме проведения генетического анализа. Еще пару лет назад основными проблемами внедрения технологий были технологические вопросы организационного характера. Сегодня процесс автоматизирован, снижается количество ручных процедур. На передний план выходят биоинформатические решения, позволяющие генерировать клинические отчеты и предоставлять полную информацию об ассоциированных с онкологическими заболеваниями мутациях», – сообщил А.Ю. Аникаев.

GeneReader – это первый секвенатор нового поколения, разработанный для онкологов – молекулярных патологов. Его рабочий процесс подразумевает использование полностью совместимых и интегрированных станций и наборов реагентов: от выделения ДНК до анализа и интерпретации результата. Единая система секвенирования GeneReader содержит решения для автоматизации всех этапов анализа: выделение ДНК, создание библиотек ДНК, контроль качества библиотек, секвенирование, анализ, интерпретация. «С развитием технологий мы движемся от понимания структуры геномов, их функционирования к пониманию механизмов развития заболеваний, развитию геномной медицины и повышению эффективности здравоохранения», – заключил специалист.


Л.Н. Любченко представила доклад «Использование высокопроизводительного секвенирования при генетическом скрининге (ГС)». Она обратила внимание на переход к персонализированной медицине, предполагающей использование данных ГС с целью оптимизации диагностики, лечения и профилактики заболеваний. Задачами ГС, в том числе с использованием NGS, являются: молекулярное профилирование с целью выявления герминальных и соматических мутаций; прогнозирование риска развития злокачественных новообразований (ЗНО); выбор методов диагностики, лечения и профилактики; прогноз здоровья потомства; планирование семьи и подбор целевого лечения.

ДНК-тестирование позволяет выявить соматические мутации из парафиновых блоков, свежезамороженной ткани, асцитической или плевральной жидкости, плазмы. Они не наследуются, определяют генотип опухоли и используются для прогнозирования эффективности полихимио- и таргетной терапии. Герминальные мутации можно детектировать, анализируя образцы периферической крови, буккального эпителия, нормальной ткани послеоперационного материала. Они наследуются и определяют высокие риски развития ЗНО, также позволяют прогнозировать эффективность терапии. Алгоритм тестирования соматических и герминальных мутаций предполагает консультацию врача-генетика на первом этапе, получение информированного согласия от пациента, сбор биологического материала. Далее обязателен пересмотр материала врачом-патоморфологом, затем выделяется ДНК и проводится ДНК-диагностика с использованием различных методов, включая ПЦР и NGS. Полногеномное секвенирование охватывает 100% генома, полноэкзомное секвенирование – 1–2% генома, таргетное секвенирование – 0,0005–0,1% генома. «Несмотря на то, что последнее открывает только малую часть генома, оно дает неоценимую информацию для клиницистов в отношении выбора тактики лечения, – подчеркнула Л.Н. Любченко. – Таргетное секвенирование – это анализ последовательности целевых генов, диагностика которых востребована в клинической практике. В последнее время разработано несколько панелей NGS-секвенирования для анализа различных генов, в том числе большие комплексные панели для охвата большого числа генов».


Показания к диагностическому NGS-тестированию были обозначены еще в 2014 г. Американской коллегией медицинских генетиков. Такое тестирование рекомендовано выполнять, когда заболевание наследуется в семье, но не удовлетворяет критериям синдрома, для которого существует диагностический ДНК-тест, или заболевание относится к группе генетически гетерогенных, или заболевание соответствует наследственному синдрому, однако результаты стандартных ДНК-тестов дали отрицательный результат. В последней версии рекомендаций NCCN для наследственного рака молочной железы (РМЖ) и яичников (РЯ) также предлагается мультигенное тестирование. За 3 года, по данным Американской коллегии медицинских генетиков, в 10 раз увеличилась частота проведения NGS-тестирования в рутинной практике лабораторий. По данным НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина, эффективность BRCA-тестирования с применением технологии NGS возросла в 3 раза по сравнению со стандартным ПЦР анализом (61,5% против 25,6% диагностированных мутаций). Специалист отметила, что возросло число пациентов с BRCA-ассоциированным РМЖ и РЯ, включенных в научные и клинические протоколы.


Л.Н. Любченко рассказала о мультигенных панелях, используемых в НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина. В частности, о панели для анализа наследственной предрасположенности к злокачественным новообразованиям ЖКТ. Она используется в случаях методологических трудностей в диагностике наследственных форм злокачественных опухолей ЖКТ: большое количество генов для анализа или их большой размер, либо отсутствие мажорных мутаций, а также необходимость сочетания нескольких молекулярно-генетических методов для достоверного определения мутаций. «В данную панель мы включили 15 генов, вовлеченных в канцерогенез рака желудка, толстой кишки, поджелудочной железы. Частота мутаций при NGS-скрининге составила 26%, частота вариантов с неизвестным клиническим значением – 42%», – сообщила эксперт.


«Последние 2 года мы проводим таргетное секвенирование с целью выявления соматических мутаций на платформе GeneReader (QIAGEN) с использованием панели GeneRead Actionable Insight Tumor Panel, включающей 12 генов. Она может использоваться для тестирования пациентов с раком молочной железы, яичников, толстой кишки, легких, меланомой. Мы используем эту панель также для рака предстательной железы и молочной железы, устойчивого к гормонотерапии», – добавила Л.Н. Любченко. По ее словам, преимуществом этой платформы является автоматизация секвенирования. GeneReader – это аппаратный комплекс, включающий станции для выделения ДНК, создания библиотек ДНК, спектрофотометр, систему капиллярного электрофореза, станцию для автоматизации клональной амплификации, секвенатор нового поколения, сервер для хранения и обработки данных, программное обеспечение для анализа. NGS-тестирование может быть автоматизированным или выполняться в ручном режиме.



С докладом «Практические аспекты определения мутаций гена EGFR при немелкоклеточном раке легких» выступила Ирина Анатольевна Демидова, к.м.н., заведующая молекулярно-биологической лабораторией Московской городской онкологической больницы № 62. Она сообщила, что в 2017 г. в России было зарегистрировано 58,6 тыс. впервые выявленных случаев немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ). Также, по словам специалиста, на IV стадии заболевание выявляется в 40% случаев (в ряде регионов – более 50%). Процент морфологической верификации растет – в 2017 г. она проводилась в 78% случаев (в ряде регионов – менее 60%). Тем не менее остается большое количество разночтений в установлении гистологической формы между региональными и референсными лабораториями – до 30%, качество препаратов зачастую неудовлетворительное, данные о химиотерапевтическом и таргетном лечении отсутствуют (нет адекватного регистра). Исследования генетических маркеров при НМРЛ не финансируются ОМС в большинстве регионов, в том числе в Москве. Применение современных методов лечения требует развития генетической диагностики.

Спикер сформулировала общие положения современных европейских, американских и российских рекомендаций по исследованию мутаций гена EGFR, перестроек ALK, ROS1: «Рекомендовано обследование всех больных с аденокарциномой легкого без учета клинических и демографических данных. Анализ назначается пациентам с распространенными формами болезни или при прогрессировании, возможно использование любого морфологического материала. Назначение анализа при плоскоклеточном раке легкого оправданно, если гистология опухоли не соответствует клиническим данным (молодой некурящий больной) или тип опухоли не может быть установлен (малые биопсии, не исключающие железисто-плоскоклеточный тип). При крупноклеточном типе рака – оправданно всегда, так как, по последним данным, 50% случаев крупноклеточного рака относится к аденокарциномам. При выявлении мутаций таргетные препараты должны быть назначены в первой линии терапии. Исследование мутаций гена EGFR должно иметь приоритет перед всеми остальными генетическими маркерами при немелкоклеточном раке легкого, следующим этапом проводится определение перестроек гена ALK. С марта 2016 года в обязательный список внесено также определение перестроек гена ROS1».


Генетическое тестирование пациентов с аденокарциномой легкого предполагает определение мутаций в 18, 19 и 21 экзонах EGFR. При положительном результате тестирование прекращается, при отрицательном – определяется транслокация генов ALK, ROS1, если отрицательный результат – определяются перестройки гена RET, мутаций BRAF, HER2, амплификации и мутаций в гене МЕТ и экспрессии PDL1. Для исследования могут использоваться биопсийный, операционный и гистологический материалы, мелкие биопсии, цитологический и другие материалы (плевральная жидкость, окрашенные гистологические срезы и плазма крови).


Далее специалист рассказала о специфике выделения ДНК: «Для биоптатов и операционного материала оптимально использование коммерческих наборов (например, QIAamp DNA FFPE Tissue Kit, QIAGEN). В конечном итоге значение имеет количество амплифицируемой ДНК. Успешное выделение достигается в среднем в 95% случаев. Если говорить о методах выявления мутаций, то в настоящее время единого рекомендуемого метода не существует, но классическим методом является секвенирование. В настоящее время практически повсеместно применяются различные виды ПЦР, в частности набор для обнаружения мутаций therascreen EGFR RGQ PCR Kit (QIAGEN). Основными его преимуществами являются высокая чувствительность и сокращенное время исследования».


Существуют и другие методы выявления мутаций: распространены все виды аллель-специфической ПЦР, пиросеквенирование, фрагментный анализ, ПЦР с высокоразрешающим плавлением, цифровая ПЦР, NGS с использованием таргетных панелей для определения соматических мутаций.


Говоря о резистентности к таргетной терапии, докладчик рассмотрела основные проблемы работы с циркулирующей опухолевой ДНК (цДНК), в том числе недостаточную чувствительность стандартных методов. В связи с этим создано огромное количество методик, ориентированных на работу с цДНК, в том числе therascreen EGFR Plasma RGQ PCR Kit. Для работы с малым количеством материала также используется цифровая ПЦР. В основе метода – эмульсионная ПЦР, при которой в каждой капле эмульсии амплифицируется одна молекула внесенной ДНК. Результат амплификации читается с помощью ридера, детектирующего флюоресцентный сигнал пробы TaqMan.


И.А. Демидова поделилась опытом клинического применения методики therascreen EGFR Plasma RGQ PCR Kit с апреля по октябрь 2018 г. За это время с ее помощью было проведено тестирование 65 первичных пациентов с недостаточным материалом для генетического исследования, обнаружено 18 пациентов с мутациями в 19 и 21 экзонах гена EGFR (26,5%). Для сравнения – среднее количество выявляемых мутаций при исследовании морфологических и цитологических препаратов составляет 19–20%. В заключение специалист подчеркнула, что «появление новых опций терапии, достоверно увеличивающих общую выживаемость определенной группы больных с немелкоклеточным раком легкого, требует обеспечения максимальной доступности лечения даже для тех больных, у которых невозможно получение адекватного количества биопсийного материала. Применение новых высокочувствительных методов дает потенциальную возможность достоверного выявления циркулирующей опухолевой ДНК и исследования ее мутационного статуса, что позволяет подобрать наиболее адекватную терапию каждому нуждающемуся пациенту».


Заключительный доклад «Использование технологии целевого секвенирования генов QIAseq в диагностике миелоидных неоплазий у детей» представила Агнеса Владимировна Панферова, к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории цитогенетики и молекулярной генетики Национального медицинского исследовательского центра детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Д. Рогачева. «На данный момент у нас большой опыт применения технологии целевого секвенирование генов QIAseq, проанализировано 628 образцов. Среди них – 301 пациент с острым миелоидным лейкозом (ОМЛ), 44 – с ювенильным миеломоноцитарным лейкозом», – сообщила специалист. ОМЛ относится к группе генетически гетерогенных заболеваний, возникает он в результате накопления последовательных приобретенных мутаций в генах ТР53, RUNX1, СЕВРА, DDX41, ANKRD26, ETV6, GАТА2. В России ОМЛ заболевает 150 детей в год, в 95% случаев это первичное заболевание.


«Мы используем целый спектр методов исследований, в том числе высокопроизводительное секвенирование. С 2016 года на рынке появилось большое количество таргетных панелей. Мы используем QIAseq Human Myeloid Neoplasms Panel (QIAGEN). Она позволяет анализировать 141 ген, в том числе гены риск-стратификации, гены предрасположенности к острому миелоидному лейкозу и другим онкологическим заболеваниям. Преимуществами этой системы являются: молекулярное баркодирование, возможность анализа вариаций числа копий генов, однородность покрытия», – рассказала А.В. Панферова. На основании данных молекулярного исследования 175 пациентов с первичным ОМЛ были разделены по подгруппам, 8 из них были стратифицированы в группу высокого риска.


Специалист сообщила, что эффективность детекции генетических нарушений, использовавшихся в лаборатории до 2016 г., составляла только 18%, сейчас с применением технологии QIAseq она выросла до 45%. Мутации в группе CBF (с гетеродимерным транскрипционным фактором, связывающимся с основными элементами многих промоторных или энхансерных фрагментов генов) ОМЛ до 2016 г. обнаруживались в 5% случаев, сейчас – в 50%.


В заключение спикер отметила высокие показатели однородности покрытия генов с панелью QIAseq (94,5–99,4%), обеспечивающие получение надежных результатов. «Это готовое решение, включающее биоинформатическую обработку данных, обладает высоким уровнем надежности, пригодным для проведения диагностики», – подытожила А.В. Панферова.



Ознакомиться с актуальными новостями и оформить подписку вы можете на сайте редакции журнала "Hi+Med Высокие технологии в медицине": http://himedtech.ru/

© 2018-2020 ООО "Медком", г. Москва. medkom.ooo@yandex.ru