Панели QIAseq 16S/ITS Panels для NGS профилирования бактериальных и грибковых сообществ

Пост обновлен 7 авг. 2018 г.

Компания QIAGEN разработала новые панели для метагеномных исследований:


• Технология «фазированных праймеров» для высококачественного basecalling

• Высокоочищенные реагенты для снижения фонового загрязнения

• Малое количество ДНК для профилирования: от 1 пг


Панели QIAseq 16S/ITS представляют собой решение «от образца к результату» для надежного профилирования бактериальных и грибковых сообществ. Панели были разработаны для секвенирования регионов 16S рРНК и ITS на секвенаторах illumina. В отличие от других решений, панели QIAseq 16S/ITS используют «фазированные праймеры», что позволяет повысить качество ридов и basecalling и устраняет необходимость в использовании PhiX. Кроме того, в панели QIAseq 16S/ITS включены высокоочищенные реагенты с низким содержанием бионагрузки для снижения уровня фонового загрязнения.


Показатели работы

Низкий уровень шума

Бактериальная ДНК присутствует во всех уголках нашей планеты, что может привести к загрязнению образцов при их получении или обработке. Кроме того, при производстве ферментов и реагентов также есть риск внесения экзогенной бактериальной ДНК в реактивы. Такая контаминация в конечном итоге может привести к искажению получаемых данных. В панелях QIAseq 16S/ITS используются высокоочищенные реактивы, которые демонстрируют очень низкие показатели контаминации экзогенной бактериальной ДНК.


Малое количество ДНК

Панели QIAseq 16S/ITS были оптимизированы для анализа сверхмалых количеств бактериальной ДНК – для протокола создания библиотек требуется всего от 1 пг до 1 нг ДНК. Это позволяет анализировать бактериальные сообщества в образцах с низкой биомассой. Для профилирования грибковых сообществ или видов панели QIAseq 16S/ITS могут детектировать до 0,01 нг грибковой ДНК на фоне 1 нг ДНК E. coli.


Мультиплексирование

Каждая панель может использоваться для мультиплексирования до 96 образцов за запуск секвенатора MiSeq с использованием проточной ячейки MiSeq Reagent Kit v3 (2×300 циклов). Для мультиплексирования необходимого числа образцов будет необходим соответствующий набор индексов.


Анализ данных

После проведения секвенирования данные анализируются с использованием инструментов QIAGEN Bioinformatics CLC Genomic Workbench и Microbial Genomics Pro Suite Module. Для упрощения анализа может быть настроен кастомный пайплайн, который позволит автоматизировать импорт файлов FASTQ, демультиплексирование образцов, фильтрацию по качеству, тримминг адаптеров, OUT кластеризацию и вторичный анализ. Программное обеспечение CLC Genomics Workbench с модулем Microbial Genomics Pro Suite позволяет исследователям создавать стандартизированные отчеты с показателями качества образцов и таблицами по содержанию тех или иных микроорганизмов, предоставляя при этом множество опций для интерактивного анализа профилей микробиомов и выбору оптимальной формы отчетов. Модуль Microbial Genomics Pro Suite также включает инструменты для расчета метрик разнообразия и сравнения микробных профилей разных образцов. CLC Genomics Workbench сразу выдает отчеты и графики в качественных и удобных форматах, пригодных для презентации полученных результатов исследования.


Принцип

Наиболее распространенным методом, используемым для профилирования микробных сообществ, является секвенирование 16S рибосомной РНК (рРНК) бактерий и внутренних транскрибируемых спейсеров или сайтов (ITS) грибов. Из-за универсального распределения и консервативной природы регионов 16S рРНК и ITS они являются хорошо исследованными генетическими маркерами, которые используются для идентификации и классификации бактерий и грибов.

Преимущества NGS секвенирования регионов 16S рРНК и ITS

NGS является эффективным методом анализа микробных сообществ в биологических образцах без необходимости культивирования. По мере увеличения пропускной способности современных секвенаторов нередко можно мультиплексировать библиотеки, полученные из нескольких биологических образцов за один запуск, что, в свою очередь, позволяет исследователям экономически эффективно анализировать сотни микробных сообществ параллельно. Определение последовательности универсальных маркерных генов, таких как гены 16S рРНК и ITS с помощью NGS является мощным методом для исследования микробных сообществ, поскольку его можно использовать для:

  • Профилирование большинства бактериальных таксонов, находящихся в образце за один анализ;

  • Проведение сравнительных исследований различных бактериальных сообществ;

  • Характеризация штаммов бактерий, которые являются некультивируемыми;

  • Более точная и быстрая классификация микроорганизмов по сравнению с традиционными методами;

  • Экономически эффективный анализ за счет мультиплексирования образцов;

  • Изучение сложных микробиомов.


Текущие трудности в NGS секвенировании генов 16S rRNA и ITS

Среди трудностей в секвенировании локусов 16S рРНК и ITS можно выделить:

  • Плохое качество чтений и basecalling;

  • Неэффективное использование пропускной способности ячейки из-за добавления контрольной ДНК PhiX;

  • Снижение эффективности классификации многих бактериальных таксонов, вызванных неполным охватом всех вариабельных областей 16S рРНК;

  • Высокий фоновый шум из-за загрязненных реагентов.


Контроль «Smart Control»

Контроль QIAseq 16S/ITS Smart Control - синтетическая ДНК, которая может быть использована в качестве положительного контроля во время этапов создания библиотек, поскольку содержит сайты связывания праймеров из генома Escherichia coli. Гипервариабельная область 16S рРНК между праймер-связывающими последовательностями заменяется искусственными последовательностями, полученными из Arabidopsis thaliana. Такие искусственные последовательности не могут быть классифицированы как бактериальные или грибковые, поэтому любые последовательности, которые так классифицируются при анализе результатов секвенирования, будут обусловлены загрязнением образцов, произошедшем во время создания библиотек.


Этапы анализа

Рабочий протокол панелей QIAseq 16S/ITS включает в себя проведение двух этапов ПЦР. Во время первой ПЦР участки вариабельных регионов 16S рРНК и ITS амплифицируются с использованием фазированных праймеров. После проведения очистки на магнитных частицах (включены в набор) проводится вторая ПЦР, во время которой адаптеры добавляются на концы ампликонов. Второй этап очистки на магнитных частицах позволяет получить уже готовые библиотеки, которые можно количественно измерить и секвенировать.

Рекомендуемые наборы для секвенирования illumina: проточные ячейки MiSeq Reagent Kits v3 (2×300 циклов), кат. номер MS-102-3003.


Области применения

Надежная идентификация бактериальных штаммов

Состав бактериального сообщества во многом зависит от анализируемого вариабельного региона 16S рРНК. Например, Streptococcus mutans не могут быть идентифицированы путем секвенирования вариабельных областей V1V2, V2V3, V3V4 и V4V5. Тем не менее, всестороннее анализ всех вариабельных областей с помощью панели QIAseq 16S/ITS позволяет обнаруживать эти бактерии.


Узнать цены и подробную информацию по панелям QIAseq 16S/ITS Panels вы можете, написав нам - alexey.anikaev@med.com.ru или info@med.com.ru


© 2018-2020 ООО "Медком", г. Москва. medkom.ooo@yandex.ru